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殺手先生（殺し屋（ころしや）聲：浪川大輔）
本名是「佐佐木龍一」，本作品的主角，職業就是職業殺手，本作登場的角色也多用殺手先生稱呼主角，興趣是獻血。殺手先生從小就立志要成為一個頂尖殺手，高中畢業之後便進入殺手專科學校（二年制）就讀。雖然擁有超一流的殺人技巧，熱衷開發各種嶄新的殺人方式，但是只有在接到委託時才會殺人，如果沒有委託則什麼生命都不能傷害，殺手先生也嚴格遵守除了和殺人有關以外的全部法律。收受的委託費用從1日圓到數十億日圓不等，端看要殺害的對象是「蘿蔔」或是人。喜愛使用的槍枝是貝瑞塔M92F手槍。
為父報仇的女高中生（父の仇女聲：野中藍）
日本福井縣內浦半島人，由於父親在5年前（第2集是6年前）被殺害，因此執意要向殺手先生報復的17歲水手服巨乳美少女。使用的武器是日本刀（初期是命名為「愛刀」的竹刀）。女高中生在劇情中的對話經常因為發音類似而被殺手先生曲解為帶有色情意味的話語，例如：免疫→Men液→進而聯想到精液。
弟子（弟子聲：淺野真澄）
父母雙亡的小學生，因為崇拜殺手這項職業而主動拜殺手先生為師。是登場角色裡面最具有常識的角色。
警長（デカ長聲：若本規夫）
中年警官，本名原田，作品中通稱「警長」。為了連續殺人事件而苦惱，雖然與殺手先生有多次近距離接觸，但是一直沒發現殺手先生的真面目。與殺手先生有許多曖昧的BL橋段。
五郎（ゴロー聲：杉田智和）
德國牧羊犬種警犬。本作品唯一識破殺手先生真面目的角色，但是卻因為殺手先生很喜歡動物，加上自己的動物本能，所以每次舉發殺手先生的行動都以失敗收場。
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